４ 実験２
４．１ 実験の準備
４．１．１ 材料
プラナリアは動物分類学上、扁形動物門、渦虫綱の総称であり、本実験にはナミウズムシ（Dugesia japonica）を用いた。ナミウズムシは、体長２０～２５mm、茶褐色～黒褐色、頭部は三角形をしており、北海道を除く日本列島全域に分布している11）。 また、プラナリアは移動性の少ない、好冷水性、好清水性の動物であり、生息分布の変動や異常再生などにより、環境汚染の指標として利用されている２7）。
本実験に用いた個体は、勢多郡富士見村箕輪、赤城白川、標高1000mで採集した個体で、１５ヶ月間飼育し、20℃の飼育条件に慣らしたものである。個体は狭い範囲で採取したものかつ長期間飼育したもので、遺伝的にはほぼ均一であるといえる。
４．１．２ 飼育用のエサ
イトミミズ（生き餌）：ペットショップより購入。
４．１．３ 飼育水
飼育水には対照水１種類と実験水５種類を用いた。飼育水は、ガラス製メスフラスコ、ガラス製細口試薬ビンに入れ、低温定温器中２０℃で保存した。飼育水は２週間ごとに新しく作りかえた。実験に用いた飼育水をTable.８に示す。
Table.８ 実験に用いた飼育水
| 飼育水 | 記号 | 溶質名(水溶液) | 溶質濃度(ppb) | 備考 |
| 対照水２ | ＣＥ | エタノール | 1.00×10３ |
|
| 実験水 | Ｍ１ | スチレン | 1.03 | エタノール1.00×10３ppb |
| 実験水 | Ｍ２ | スチレン | 1.03×10－２ | エタノール1.00×10ppb |
| 実験水 | Ａ１ | ビスフェノールＡ | 2.00×10３ |
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| 実験水 | Ａ２ | ビスフェノールＡ | 5.0 |
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| 実験水 | Ａ３ | ビスフェノールＡ | 5.0×10－２ |
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４．１．４ 対照水２の調整
水道水1000?をガラス製１?ビーカーに入れ、５分間沸騰させ、２０℃まで冷却したものを対照水（Ｃ）とした。エタノール1?に対照水（Ｃ）を加え1000?とし、そのエタノール水溶液1?に対照水（Ｃ）を加え1000?としたものを対照水２（ＣＥ）とした。対照水２（ＣＥ）はエタノール水溶液でエタノール濃度は1000ppbである。この濃度は、スチレン実験水１（Ｍ１）に含まれるエタノール濃度と同じ値である。
４．１．５ 実験水の調整
４．１．５．１ 調整のルール
・実験水は対照水（Ｃ）を用いて調製した。
・原液は調製に用いたガラス製メスフラスコ中に入れたまま、約２～３℃で保管した。 また、保存中の水の蒸発を防ぐ目的で栓周囲をパラフィルムで覆った。
４．１．５．２ スチレン実験水の調整
スチレンはベンゼン環にビニル基が付加した構造（Fig.１０）をもち、融点－30.69℃、沸点145.2℃、比重ｄ４２０=0.9090の無色透明の液体で芳香をもっている。実験に使用したスチレンは東京化成工業（株）東京化成特級（ガスクロマトグラフ法により99.0％以上）を用いた。
Fig.１０ スチレンの構造式
ポリスチレンは、一般に、エチレン（エチレンモノマー）とベンゼンからエチルベンゼンを介して得られたスチレン（スチレンモノマー）を重合させたポリマー（プラスチック）である。したがって、製品にはこれら揮発性原料などが残留している可能性があり、食品衛生法に基づく規格基準では材質中の揮発性物質の規制をおこなっている。熱水を用いる発砲ポリスチレンは残留物の濃度が2000ppm以下かつスチレン及びエチルベンゼンの濃度がそれぞれ1000ppm以下と定められている。しかし、カップラーメン容器は、メーカーがそれよりも厳しい自主規制をおこなっているという２５)。このため残留物濃度、熱水への溶出濃度にもかなりのばらつきがある。
・ポリスチレン製カップラーメン容器２９品について室温の水を入れ３０分放置後で 不検出（検出限界10ppb）～120ppb２０)のスチレンモノマーが溶出した。
・食品用ポリスチレン製容器２１４品に熱水を入れ３０分放置後で最高44ppb２１)のスチレン モノマーが溶出した。
・カップラーメン容器に沸騰水200mlを加え、アルミはくでふたをし、 ５分後で1～33ppb２２）のスチレンモノマーが溶出した。
そこで、実験水の濃度設定はスチレン溶出報告の最小値を参考に、実験水Ｍ１のスチレン濃度を1.0ppbに設定した。また、検出限界を考慮し実験水Ｍ２は0.010ppbに設定した。
（１）～（５）はスチレン実験水の調整方法である。また、Fig.１１はスチレン実験水の調製手順をモデル化したものである。
（１）スチレン 0.5132 ｇを500? のエタノール溶液にした。
濃度計算：0.5132／500＝1.0264／10３＝1026.4／10６＝1026.4ppm →原液①
エタノール濃度：100％
（２）原液①10?を1000?の水溶液にした。
濃度計算：1.0264／10６×10／1000＝10.264／10６ ＝10.264ppm →原液②
エタノール濃度：1／100＝１％
（３）原液②10?を1000?の水溶液にした。
濃度計算：10.264／10６ ×10／1000＝0.10246／10６ ＝0.10246ppm →原液③
エタノール濃度：1／10４ ＝100 ppm
（４）原液③10?を1000?の水溶液にした。
濃度計算：0.10246／10６×10／1000＝1.0264／10９＝1.0246 ppb →（Ｍ１）
エタノール濃度：1／10６ ＝１ppm
（５）スチレン実験水（Ｍ１）10?を1000?の水溶液にした。
濃度計算：1.0264／10９ ×10／1000＝0.010246 ppb→（Ｍ２）
エタノール濃度：1／10８ ＝10 ppb
スチレン実験水には（Ｍ１）、（Ｍ２）を用いた。
４．１．５．３ ビスフェノールＡ実験水の調製
ビスフェノールＡはフェノール基をふたつもった構造（Fig.１２）で、フェノールとアセトンから合成される。主にポリカーボネート樹脂、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、殺菌剤、ゴム酸化防止剤の原料、塩化ビニールの安定剤、歯科材料の合成原料などに用いられ、乳ガン細胞を増殖させる、マウスの精子を減少させるなどの環境ホルモン作用が報告されている２）～５）。実験にはキシダ化学（株）１級（融点154～157℃）を使用した。
Fig.１２ ビスフェノールＡの構造式
実験水の濃度は、以下の理由から設定した。食品衛生法で定めたビスフェノールＡの基準値2500ppbを参考にして、実験水Ａ１の濃度を基準値上限付近2000ppbとした。日本子孫基金が横浜国立大学環境科学研究センターに依頼しておこなった、ポリカーボネート製哺乳瓶からのビスフェノールＡ溶出検査では、水95℃における溶出量3.1～5.5ppbであった２）。これを参考にして、実験水Ａ２の濃度を検出値上限付近5.00 ppbとした。環境庁がおこなった1996年度化学物質環境安全性総点検調査での検出地の検出値が水質0.010～0.268ppb、魚類0.015～0.287ppbであった２６）。これを参考にして、実験水Ａ３の濃度を検出値下限付近0.0500 ppbとした。
（１）～（５）はビスフェノールＡ実験水の調整方法である。また、Fig.１３はビスフェノールＡ実験水の調製手順をモデル化したものである。
（１）ビスフェノールＡ 0.0100ｇを1000?の水溶液にした。
濃度計算：0.0100／10３ ＝10／10６＝10.0ppm →原液①
（２）原液①10?を 1000?の水溶液にした。
濃度計算：10／10６×10／1000＝100／10９ ＝100 ppb →原液②
（３）原液①200?を1000?の水溶液にした。 濃度計算：10／10６× 200／1000＝2000／10９ ＝2000 ppb →（Ａ１）
（４）原液②50?を1000?の水溶液にした。
濃度計算：100／10９× 50／1000＝5.00 ppb →（Ａ２）
（５）実験水（Ａ２）10?を1000?の水溶液にした。
濃度は 5／10９× 10／1000＝0.0500 ppb →（Ａ３）
ビスフェノールＡ実験水には（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）を用いた。
４．１．6 調製誤差の検討
実験水の調製では多段階の希釈をおこなった。この結果、実験器具の精度を超えた誤差が生じると考えらる。このため、濃度がどの程度まで確かなのかを検証した。器具の誤差は、電子天秤は仕様書を参考にし、ホールピペット５０ｍｌ、１００ｍｌの許容誤差はJIS R3505-1994ｸﾗｽＡとし、他のガラス体積計はJIS R3505-1994ｸﾗｽＢの許容誤差内にあるものとした。はかりとった質量、体積を秤量値とし、それに器具精度を加えたものを最大値、引いたものを最小値とした。濃度計算においては、秤量値から計算した値を調整値とし、常に濃度最大となる方向に誤差が生じた場合の値を最大値とし、常に濃度最小となる方向に誤差が生じた場合の値を最小値とした。また、調整値を真の値と仮定し、最大値または最小値から調整値を引いた値を誤差とし、誤差と最大値、最小値の比を誤差率とした。
Table.９は、実験水の調製に用いた器具である。Table.１０はスチレン実験水の誤差検証の過程である。スチレン実験水においてはＭ１、Ｍ２ともに２％程度の誤差率であった。検証の結果、有効数字２桁までは保証でき、３桁目に誤差を含む。そこでＭ１の濃度を
1.03ppb、Ｍ２の濃度を0.0103ppbとする。
Table.１１はビスフェノールＡ実験水の誤差検証の過程である。ビスフェノールＡ実験水においてはＡ１は２％程度の誤差率で、有効数字２桁までは保証でき、３桁目に誤差を含む。Ａ２、Ａ３はともに３％程度の誤差率で、有効数字１桁までは保証でき、２桁目に誤差を含む。そこでＡ１の濃度を2.00×10３ppb、Ａ２の濃度を5.0ppb、Ａ３の濃度を0.050ppbとする。
Table.９ 実験水の調製にもちいた器具の精度
| 質量・体積測定器具 | 精度 | 最小(g) |
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| AG245(Mettler-Toledo GmbH) | ±0.0002(g) | 0.0001 |
| ホールピペット １ｍｌ | 0.02(ml) |
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| ホールピペット １０ｍｌ | 0.04(ml) |
| ホールピペット ５０ｍｌ | 0.05(ml) |
| ホールピペット １００ｍｌ | 0.08(ml) |
| メスフラスコ ５００ｍｌ | 0.5 (ml) |
| メスフラスコ １０００ｍｌ | 0.8 (ml) |
Table.１０ スチレン実験水調製過程における誤差の検証
Table.１１ ビスフェノールＡ実験水調製過程における誤差の検証
４．１．7 飼育・観察・記録の方法
（1）飼育方法
①プラナリアには有性生殖と無性生殖がある。プラナリアの生活史は水温に強く支配されており夏期に低温下（５～１０℃）で飼育すると、有性系個体では生殖器官が退化せず、無性系個体では分裂しなくなる。また、冬季でも高温（２０～２５℃）のもとで飼育すると、生殖器官が退化して有性系の虫でも横分裂するようになる１０）。そこで、プラナリアを分裂によって増やすため２０℃で飼育することとした。また、飼育容器には直径８cmのガラス製シャーレを用いた。
②週２回（月・木曜日）エサを与える。エサの量は、プラナリア１匹に対し、イトミミズ2～3匹程度とする。
③エサを与えた翌日（火・金曜日）に、飼育容器の掃除、飼育水の取り替えを行う。 （2）観察・記録方法
①観察は毎日行い、別紙記録用紙に記録する。
②観察・記録項目
ⅰ 観察年月日および飼育開始からの経過日数
ⅱ 低温定温器の温度
ⅲ 各飼育容器中のプラナリアの個体数
ⅳ 各プラナリアの状態
４．２ 実験の方法
４．２．１ 対照実験区２（記号ＣＥ）
６つのガラス製シャーレにエタノールを溶かした対照水２（ＣＥ）（30?）とプラナリア１匹を入れ分裂による個体数の変化を記録した。
Fig.１４ 対照実験区２（ＣＥ－１～ＣＥ－６）
４．２．２ スチレン実験区１ （記号Ｍ１）
６つのガラスシャーレにスチレンを溶かした実験水Ｍ１（30?）とプラナリア１匹を入れ分裂による個体数の変化を記録した。
Fig.１５ スチレン実験区１（Ｍ１－１Ｍ１－６）
４．２．３ スチレン実験区２ （記号Ｍ２）
６つのガラスシャーレにスチレンを溶かした実験水Ｍ２（30?）とプラナリア１匹を入れ分裂による個体数の変化を記録した。
Fig.１６ スチレン実験区２（Ｍ２－１～Ｍ２－６）
４．２．４ ビスフェノールＡ実験区１ （記号Ａ１）
６つのガラスシャーレにビスフェノールＡを溶かした実験水Ａ１（30?）とプラナリア１匹を入れ分裂による個体数の変化を記録した。
Fig.１７ ビスフェノールＡ実験区１（Ａ１－１～Ａ１－６）
４．２．５ ビスフェノールＡ実験区２ （記号Ａ２）
６つのガラスシャーレにビスフェノールＡを溶かした実験水Ａ２（30?）とプラナリア１匹を入れ分裂による個体数の変化を記録した。
Fig.１８ ビスフェノールＡ実験区２（Ａ２－１～Ａ２－６）
４．２．６ ビスフェノールＡ実験区３ （記号Ａ３）
６つのガラスシャーレにビスフェノールＡを溶かした実験水Ａ３（30?）とプラナリア１匹を入れ分裂による個体数の変化を記録した。
Fig.１９ ビスフェノールＡ実験区３（Ａ３－１～Ａ３－６）
注）2000年５月５日～2000年７月２０日までの７６日間観察した。
観察期間中の水温は、平均値20.0℃、最大値20.2℃、最小値19.8℃であった。